Introduktion till vävnadstypningslaboratoriet
Introduktion
Metoder och förkortningar
Personal
Vävnadstypningslaboratoriet tillhandahåller framför allt service till transplantationsverksamheten och ingår i ett nordiskt samarbete, Scandiatransplant. De ingående länderna i detta samarbete är Sverige, Norge, Danmark, Finland och Island.
Laboratoriet är ackrediterat enligt EFI (European Federation for Immunogenetics)
På vävnadstypningslaboratoriet undersöks vävnadstyp och antikroppsstatus hos patienter som är aktuella för transplantationer av njure, lever, tarm, pancreas, lunga, hjärta eller benmärg/stamceller. Organen kan komma från levande donatorer (njurar och lever), s.k. LD-transplantation, eller från avlidna donatorer, s.k. nekrodonation. Vid nekrodonation väljs recipienter från väntelistan och hänsyn tas till blodgrupp, ålder, antikroppsstatus, matchgrad, tidigare tranplantat, allmänstatus, m.m.
Vävnadstypning innebär detektion av gener för HLA (human leukocyte antigen) som uttrycks på ytan av en individs celler. Det finns två klasser av HLA-loci, klass I respektive klass II. Klass I benämns HLA-A, B, C, E, F, G och uttrycks på alla kroppens celler. Klass II benämns HLA-DR, DQ och DP och uttrycks främst på antigenpresenterande celler. Varje antigenlocus har två alleler, en från vardera förälder. De antigen som framförallt anses kliniskt relevanta vid transplantation är HLA-A och -B samt HLA-DR och -DQ. Vävnadstypningar utförs med PCR-SSP/SSO.
Antikroppsstatus är en bestämning av mängd och specificitet hos HLA-antikroppar hos en patient. HLA-antikroppar kan bildas vid transplantation, blodtransfusion och graviditet, dvs vid tillfällen då celler med främmande HLA introduceras för patientens immunsystem. De kliniskt mest relevanta HLA-antikropparna är av IgG-typ. Antikroppar kan detekteras med tre olika metoder: CDC, FC eller Luminexteknik. Luminextekniken, som är den mest känsliga, används för att screena alla HLA-antikroppsprover. FC och CDC ger en PRA-procent för antikroppspositiva prover.
Inför en transplantation utförs ett korstest (XM), dvs en förenlighetsprövning, där patientens serum/plasma testas mot en donators celler. Korstest kan göras med två olika metoder: CDC-XM eller FC-XM. Transplantation sker ej mot positivt resultat med CDC-XM.
Matchgrad innebär att man räknar ut hur många antigen som skiljer recipient och donator åt, dvs hur många nya antigen som introduceras för recipienten. Man räknar på A, B och DR och anger resultatet A+B/DR. Då varje locus har två alleler kan det som mest bli 6 mismatcher (skrivs 4/2). En perfekt matchning ger matchgraden 0/0.
Efter transplantation kan rejektion uppstå hos recipienten, dvs patientens immunsystem försöker stöta bort det transplanterade organet. Rejektioner kan vara cellulära och/eller antikroppsmedierade (humorala). De hyperakuta rejektionerna beror ofta på att patienten har antikroppar innan transplantation.
Vävnadstypning används även vid diagnostik av vissa sjukdomstillstånd som är associerade med specifika vävnadstyper inom HLA-systemet. Exempel är HLA-B*27 (Morbus Bechterew), HLA-DQ*06:02 (narkolepsi).
LCT (Lymphocyte Cytotoxicity Test)
Äldre förkortning som användes för att beteckna undersökning av HLA-antikroppar.
DSA (donor specific antibodies)
Donatorsspecifika antikroppar detekteras med Labscreen single (Luminex).
PRA (Panel Reactive Antibodies)
Varje år körs ett antal CDC-försöks med celler från kända donatorer som tillsammans representerar ett stort spektrum av antigen, en panel. Patienter som har antikroppar får då en PRA-procent, dvs den andel av panelcellerna som deras antikroppar reagerar med.
CDC (Complement Dependent Cytotoxicity)
CDC är en metod där celler från en donator inkuberas med serum/plasma från en recipient och därefter tillsätts komplement. Om serumet/plasman innehåller antikroppar som kan binda till cellerna och dessa antikroppar kan aktivera komplement så initieras komplementkaskaden som leder till bildning av MAC (membrane attack complex) och cellen lyseras. Om antikropparna inte binder in så sker heller ingen lysering av cellen. Med acridine-orange/etidiumbromid-färgning särskiljs lyserade från hela celler.
Vid undersökning av specificitet hos eventuella antikroppar inkuberas ett patientserum med okänd antikroppsstatus mot celler från en rad givare med kända antigen. Om cellerna lyseras vet man att patienten har antikroppar mot ett eller flera av dessa specifika antigen.
CDC är fortfarande standard och används på alla transplantationscentrum, även om andra tekniker är mer känsliga.
FC (Flödescytometri)
Beads (mikrosfärer) med antigen bundna till ytan eller T-celler och B-celler från donator inkuberas med recipientens serum/plasma. En sekundär fluorescerande antikropp tillsätts och komplexen separeras och detekteras i flödescytometri med laser m.a.p. storlek, granularitet och fluorescens.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Amplifieringsmetod för DNA. Sekvensspecifika primers (SSP), Taq polymeras, nukleotider och buffert inkuberas med DNA i ett antal temperaturcykler. Varje cykel har olika steg som ger denaturering (DNA blir enkelsträngat), annealing (inbindning av primer till DNA strängen) och elongering (polymeraset syntetiserar en ny komplementär DNA-sträng från primer-inbindningsstället) av DNA. För varje cykel dubbleras mängden DNA vilket ger en exponentiell amplifiering av de med primers utvalda sekvenserna. PCR-produkterna kan därefter separeras med gelelektrofores.
Luminexteknik
Metoden kan användas för att detektera antikroppar (LabScreen) eller antigen (LabType).
LabScreen innebär att eventuella antikroppar i patientserum får binda in till beads med antigen. En sekundär fluorescerande antikropp tillsätts och komplexen avläses med laser m.a.p. fluorescens. LabScreen är en känsligare metod än FC. Labscreen kan köras med beads täckta med flera antigen (LabScreen mixed) eller med ett enskilt antigen (LabScreen single). För att detektera DSA (Donor Specific Antibodies) körs LabScreen single.
LabType-tekniken innebär att specifika HLA-biotinylerade PCR-produkter som amplifierats från patientens DNA får binda in till beads med komplementära sekvensspecifika oligonukleotider (SSO). Komplexet inkuberas med SAPE (straptavidin-phycoerythrin som binder biotin) och positiva beads kan då detekteras med laser.
XM-ONE
Även antikroppar riktade mot antigen utanför ABO- och HLA-systemet kan vara kliniskt relevanta. Med XM-ONE undersöks om recipienten har antikroppar mot endotelcellsantigen. Endotelcellsprekursorer isoleras från perifert blod och inkuberas som för FC-XM med recipientens serum/plasma. En sekundär antikropp tillsätts och komplexet detekteras med flödescytometri.
På vävnadstypningslab arbetar BMA och läkare.
Om du har frågor som rör Vävnadstypningslaboratoriet kontakta gärna:
Berit Waldner 031-342 78 62